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1我们掌握的基因重组病毒生产关键工艺技术


细胞培养技术

我司在细胞培养方面拥有较强实力,能在T25至T225以及细胞工厂和生物反应器等多种不同大小规格的培养容器中对贴壁细胞

、悬浮细胞、依赖型细胞等多种细胞熟练培养,能系统的完成诸如细胞驯化等具有较高技术难度的细胞相关实验。

贴壁细胞培养

贴壁细胞培养主要是采用含10%血清的DMEM培养液,在37.0℃,5.0%CO2的条件下静置培养,待细胞生长至80%-90%时进行

消化并扩增。常规培养的贴壁细胞有:293、293T、Hela、Vero、BHK-21、A549等。能对细胞进行复苏、传代、冻存等常

规实验熟练操作。

悬浮细胞培养

悬浮细胞培养主要是采用无血清的完全培养液,在37.0℃,5.0-8.0%CO2的条件下静置或摇动培养。待细胞生长至一定密度时

通过补加无血清培养液稀释细胞来进行连续培养。常规培养的悬浮细胞有:HER096、Hela-F、293F等。其中Hela-F细胞和

293F细胞是经本公司驯化而来的。

细胞驯化

本公司已成功驯化出多个细胞系,如:Hela-F细胞系、293F细胞系等。能针对某种细胞对多种无血清培养液进行筛选,筛选出

该细胞最适合的无血清培养液,并对培养工艺进行优化等。

Hela细胞(驯化前贴壁)

Hela-F细胞(驯化后悬浮)

病毒扩增技术

小试扩增

病毒种类 生产细胞 培养容器 收获方式
腺病毒 HEK293(贴壁),HER096
细胞(悬浮)或是客户自行
提供所用细胞
225cm2培养瓶/
10层细胞工厂
293细胞扩增拍打即可脱落收集,
悬浮细胞扩增直接收集,离心,
用病毒保存液重悬
慢病毒 293T 225cm2培养瓶 病毒颗粒分泌到细胞外的培养基
中,收集上清
痘苗病毒 Hela(贴壁、悬浮)、
BHK-21或是客户自行提供
所用细胞
175cm2或225cm2
培养瓶
贴壁细胞扩增收获时需要用细胞
刮刀收集,悬浮细胞直接收集,
离心,用病毒保存液重悬



NBS反应器灌流培养技术

本司NBS反应器配有5L细胞罐、7.5L细胞罐和14L细胞罐,主要用于293细胞贴壁培养,扩增腺病毒。

NBS反应器主要技术特色:

片状载体(FibraCel)培养:表面积/体积(S/V)大,因此单位体积培养液的细胞产率高;把悬浮培养和贴壁培养融合在一起,

兼有两者的优点;简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制,重现性好;培养基利用率较高;细胞收获过程不复杂;劳动强

度小;培养系统占地面积和空间小。

灌流培养:不断地加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的培养基,使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内增殖,

既省时省力,又减少了细胞发生污染的机会,且可以提高细胞密度10倍以上,当细胞达到一定密度,接入病毒进行感染,最终

获得的腺病毒颗粒可达到1015vp。

WAVE波浪式生物反应器无血清悬浮培养技术

本司拥有的WAVE波浪式生物反应器可选择100ml-25L的培养体积,主要用于无血清悬浮细胞的培养,扩增腺病毒/痘苗病毒

WAVE主要技术特色:

WAVE波浪式生物反应器配套使用一次性细胞培养袋,由医药级材质制成,预先经过辐照灭菌,有效避免反应器的清洗和验证

缩短工艺开发和生产周期。无菌的细胞培养袋不仅提高细胞培养成功率,密闭的培养系统可避免料液和操作人员的直接接触,

确保生物操作安全。氧气的交换通过WAVE的来回摆动来完成,从而提供温和低剪切力高溶氧的细胞培养微环境,有利于改善

细胞状态、提高细胞密度和产量。细胞密度最高可达1E+07/ml。WAVE波浪式生物反应器培养体积范围灵活、操作简单、控

精密可靠、易于工艺放大。

无血清培养基成分限定高、生理环境易于控制,利于下游纯化工艺的开展,在培养悬浮细胞制备病毒的操作中具有明显优势。

20L细胞袋扩增腺病毒颗粒可达到1015vp。

无血清工艺是生物制药细胞培养技术的发展趋势。无血清培养基成分安全可控。无血

清工艺提高了产品质量,缩短了生产周期。


病毒纯化技术

公司具有基因重组病毒纯化平台,可纯化多种类型病毒,包括腺病毒、慢病毒、痘病毒,正进一步开发疱疹病毒

、腺相关病毒等病毒的纯化方法。

公司具有非常成熟的腺病毒纯化技术,可纯化由NBS细胞罐和WAVE细胞袋培养的Ad5、

Ad2和Ad35三种广泛使用的腺病毒载体,可纯化出保持高病毒活性、高纯度、高浓度的符合药品质量标准要求的

重组病毒产品。

公司建立了完善的慢病毒纯化平台,可纯化由方瓶培养的HIV和SIV两种类型的慢病毒载体。纯化出的慢病毒产

符合药品质量标准,可用于基础研究、临床前研究及临床研究。

离心

利用离心力,分离液体与固体颗粒或液体与液体混合物中各组分的方法,生物制品常采用高速冷冻离心机进行初级分离纯化。

我司使用Beckman Avanti J20XPI离心机去除细胞碎片等大颗粒杂质或浓缩收集病毒。在中试规模生产时,使用连续流离心

可处理100L规模的收获液。在慢病毒纯化中,可用超速离心法收集病毒沉淀。

过滤

预过滤是生物制药领域去除颗粒杂质和减少生物负荷的常用方法。过滤有效成分损失极少,产品无形态变化,无化学变化,处

理规模大,效率高。

超滤

超滤是一种加压膜分离技术,即在一定的压力下,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜,而大分子溶质不能透过,

留在膜的一边,从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤膜的孔径小于0.1μm,可根据需要选择孔径大小,具有高效率、低

能耗的分离特点。在病毒纯化中,可去除一些小分子杂质,同时浓缩病毒收获液。

我公司采用切向流超滤,低剪切力、高通量,产品活性回收率高、处理量大。

柱层析

公司拥有AKTA纯化系统,可进行柱层析纯化。AKTA explorer装置有双通道高效梯度泵,多波长紫外可见检测器,在线电导

和pH检测器,流速范围0.01-100 ml/min,压力高达10Mpa,可用软件UNICORN控制监测,操作简单,精确性高,适用于

方法开拓和研究应用,以及中试规模生产。

我公司采用柱层析纯化的方法纯化病毒,主要包括离子交换层析和凝胶层析,过程中不产生热,不产生外力,高回收率,高分辨

率,可线性放大,可自动化,并有大量成功例子。

离子交换层析是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别

而进行分离的一种层析方法。在腺病毒纯化中,根据不同的病毒类型,将多种填料Source 30Q,Q Sepharose XL,

Fractogel DEAE,分别应用。离子交换层析中,低盐浓度上样,高盐浓度收取目的峰,有利于在纯化过程中保持病毒的生物

活性,但需要及时降低盐浓度。

病毒保存液配方及制剂分装技术

病毒保存液配方

根据不同的病毒种类,分别有不同的保存液配方,包括腺病毒保存液配方、慢病毒保存液配方、痘病毒保存液配方等。

分装

可按客户要求分装不同规格的小容量液体注射制剂(符合GMP生产要求)。