华人学者高光坪Nature子刊发文，详述基因治疗明星载体腺相关病毒(AAV)丨医麦猛爆料

2019年2月15日/医麦客 eMedClub/--近日，权威期刊Nature Reviews Drug Discovery针对“腺相关病毒(AAV)载体作为基因治疗递送的平台”展开讨论，其中通讯作者为国际基因治疗领域著名专家、美国基因与细胞学会当选主席高光坪教授，同时他也是Voyager Therapeutics的创始人之一。

腺病毒相关病毒(AAV)最早是在20世纪60年代中期从实验室腺病毒(AdV)制剂中发现的，并且很快就在人体组织中发现。

在纯科学的好奇心驱使下，一些研究小组开始了解基本AAV生物学的过程，此时并没有意识到其作为人类基因治疗平台的巨大潜力。在AAV研究的前15-20年中，AAV的几个重要方面被表征，包括其基因组构型和组成、DNA复制和转录、感染潜伏期和病毒粒子组装。这些成果共同促进了野生型AAV2序列成功克隆到质粒中，从而实现了基因研究和整个AAV2基因组测序。早期研究提供了使用AAV作为基因传递载体的基础知识。

50年AAV时间线（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery ）

现如今，重组AAV(rAAV)已经成为体内基因治疗递送的主要平台。第一种rAAV基因治疗产品是uniQure公司的alipogene tiparvovec(Glybera)，于2012年被欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症；2018年，FDA批准了voretigene neparvovec-rzyl(Luxturna)，这是第一个获得美国许可的rAAV基因疗法。

AAV属于细小病毒科，Dependoparvovirus属。它的生命周期依赖于辅助病毒的存在，例如AdV。AAV存在于多种脊椎动物中，包括人类和非人类灵长类动物(NHP)。目前的共识认为AAV不会引起任何人类疾病。

它由直径约26nm的二十面体蛋白质衣壳和~4.7 kb的单链DNA基因组组成。衣壳包含三种类型的亚基VP1、VP2和VP3，总共60种拷贝，比例为1:1:10(VP1:VP2:VP3)。基因组的两端是两个T形反向末端重复序列(ITR)，其末端主要用作病毒复制起点和包装信号。rep基因编码病毒复制所需的四种蛋白质；它们以其分子量命名：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。cap基因通过来自不同起始密码子的可变剪接和翻译编码三个衣壳亚基。此外，编码组装活化蛋白(AAP)的第三个基因在不同阅读框中的cap编码序列内编码，并且已显示出促进病毒粒子组装。

AAV和AAV载体的基因组结构（图片来源：Semantic Scholar）

AAV基因组可以整合到人细胞中称为AAVS1的基因组基因座中以建立潜伏期。这种现象部分是由于AAVS1中发现的序列相似性以及ITR和Rep活性。如下所述，因为rAAV缺乏rep基因，所以rAAV基因组整合大大减少。

实际上，rAAV由与野生型AAV(wtAAV)中发现的相同的衣壳序列和结构组成。然而，rAAV包装的基因组删除了全部AAV蛋白编码序列，并且添加治疗性基因表达盒。唯一的病毒来源序列是ITR，它们是在载体生产过程中指导基因组复制和包装所必需的。病毒编码序列的完全去除使rAAV的包装能力最大化，并且有助于它们在体内递送时的低免疫原性和细胞毒性。

rAAV最佳地装载5.0kb以下的基因组，因此必须仔细设计有效负载，不仅要考虑治疗性转基因序列，还要考虑基因表达所必需的调控元件(例如，启动子和多聚腺苷酸化信号)。

一旦将rAAV施用于患者，影响基因递送效力的宿主因子就起作用。例如，新发现表明不同血清型以不同方式与血清蛋白相互作用。尽管如此，rAAV的有效性在很大程度上取决于衣壳和靶细胞表面受体之间的分子相互作用，以及随后颗粒内化后的下游事件。

rAAV转导通路（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery ）

rAAV的复制和包装依赖于宿主细胞因子和辅助病毒提供的元件，如单纯疱疹病毒(HSV)和AdV。因此，鉴于现有技术，用于生产rAAV的无细胞系统仍然难以实现。开发增强rAAV生产效率的方法一直是人类应用的持续挑战。

关键点：rAAV的长期存在是否可以通过载体基因组整合导致遗传毒性？

腺相关病毒(AAV)作为基因治疗载体的最有希望的属性之一是，其在人类中的低遗传毒性特征，以及缺乏强有力的直接证据表明rAAV可以在人类中引起载体基因组介导的宿主遗传毒性。普遍的想法是rAAV基因组仍然主要以附加体(episome)的形式存在于宿主细胞核。

肝细胞癌(HCC)和AAV载体整合之间的关联首次报道于2007年，并通过载体基因组的同源定向整合正式证实。推动整合的确切机制尚不完全清楚，也未达成共识。

在细胞培养模型和特定条件下的小鼠中的研究证明，rAAV基因组的整合在高感染复数下发生，并且表现出优先整合到Rian基因组基因座中，该基因座是鼠基因组特有的区域。这些报告目前被认为与临床环境无关。重要的是，对患者样本(给药后1年)和非人类灵长类动物(注射后1个月)的研究表明，整合的可能性很低并且缺乏在已知的HCC驱动基因附近的整合。

由于rAAV在临床试验中的安全记录和在该领域内的共识，很少有工作专门针对限制基因毒性整合事件的策略。尽管如此，通过调节控制盒限制附近基因反式激活的绝缘子元件的设计有望减少由于杂散整合引起的遗传毒性效应。

自然发现、合理设计、定向进化和计算机生物信息学方法。

衣壳发现和工程的四种主要方法（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery ）